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OPTIMIZANDO PROTOCOLOS PARA MEJORAR EL BIENESTAR
ANIMAL MEDIANTE LA CONSERVACIÓN DE SEMEN EQUINO
Nadia Cristina Remezovski Luzko
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Universidad de Buenos Aires - Argentina
María Alejandra Stornelli
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Universidad Nacional de La Plata - Argentina
Marcelo Horacio Miragaya
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Universidad de Buenos Aires – Argentina
Recibido: 18/12/2021
Aprobado: 12/01/2022
RESUMEN
El transporte del semen refrigerado y su uso mediante inseminación artificial (IA) es una
práctica rutinaria en reproducción equina la cual evita el transporte de animales, reduce
riesgos, estrés animal y costos de traslado y aumenta las posibilidades de uso de un
reproductor (Douglas- Hamilton 1987). En las últimas décadas la IA con semen
congelado en equinos ha adquirido gran importancia. La mencionada biotecnología
permite almacenar material genético de valor y utilizarlo incluso cuando los padrillos ya
no están disponibles, pudiendo distribuirse el material genético de un padrillo por todo el
mundo. La refrigeración de semen diluido y su almacenado por algunas horas
conservando parámetros seminales similares a los del semen fresco permitiría trasladar el
semen hasta un laboratorio para su posterior congelamiento. Este hecho haría posible
realizar la colecta de semen a campo y el traslado del eyaculado permitiendo el
congelamiento sin necesidad de trasladar a los padrillos o contar con un laboratorio in
situ. El objetivo fue estudiar la supervivencia espermática en semen equino luego de la
refrigeración a 4°C durante 4 horas y post-descongelamiento. Se utilizaron 10 padrillos
Se recolectaron con vagina artificial dos eyaculados de cada animal. Luego del filtrado
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Becario de Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, BECAL PARAGUAY.
nadiareme@hotmail.com
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Profesor Asociado de la Cátedra de Reproducción Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata.
[email protected]p.edu.ar
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Profesor del área de Teriogenología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires. mmirag@fcv.uba.ar
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se evaluaron las características macroscópicas: Color, Aspecto, Volumen (ml) y
microscópicas: (AndroVision®, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Germany) Movilidad
progresiva (MP); Porcentaje de vivos con tinción de Eosina – Nigrosina [% PV]; prueba
de HOS ([% de colas enrolladas] post incubación en solución de lactosa 50mOsm).
Acrosomas intactos (AI, % de acrosomas intactos) El semen filtrado fue diluido a una
concentración de 50 x106 por ml en un diluyente base leche descremada-glucosa,
almacenado a 4°C durante 4 h y posteriormente se realizó el congelamiento. En ambas
etapas, el semen fue sometido a las pruebas de contrastación microscópicas descritas
anteriormente. Los datos obtenidos fueron analizados mediante ANOVA. La
significancia fue establecida como p≤0,05. Se observaron valores semejantes de MP, VM,
HOS y AI en semen fresco y luego de 4 hs de refrigeración. Así mismo, estos últimos se
compararon con los valores post descongelamiento (57,6±4,8 vs 20,07±5,8; 66,5±2,8 vs
60,9 ± 3,8, 66,5±3,5 vs 36,09±5,1; 80,4±2,6 vs 60,3±3,6 respectivamente). Nuestros
resultados sugieren que el semen refrigerado podría ser transportado y congelado luego
de 4h de almacenado a 4°C permitiendo colectar en el campo y criopreservar en un
laboratorio debidamente equipado sin necesidad de trasladar a los equinos. Futuros
estudios permitirán profundizar los conocimientos en refrigeración por cortos periodos
previos a la congelación.
Palabras-clave: Equino - Semen – Criopreservación.
ABSTRACT
The transport of refrigerated semen and its use by artificial insemination (AI) is a routine
practice in equine reproduction which avoids transporting animals, reduces risks, animal
stress and transportation costs and increases the chances of using a breeder (Douglas-
Hamilton 1987). In the last decades, AI with frozen semen in equines has acquired great
importance. This biotechnology makes it possible to store valuable genetic material and
use it even when stallions are no longer available, and the genetic material of a stallion
can be distributed worldwide. Refrigerating diluted semen and storing it for a few hours
while preserving semen parameters similar to those of fresh semen would allow the semen
to be transferred to a laboratory for subsequent freezing. This would make it possible to
collect semen in the field and transfer the ejaculate to a laboratory for freezing without
the need to transport the stallions or to have a laboratory on site. The objective was to
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study sperm survival in equine semen after refrigeration at 4°C for 4 hours and post-
thawing. Ten stallions were used. Two ejaculates from each animal were collected with
an artificial vagina. After filtration, macroscopic characteristics were evaluated: Color,
Appearance, Volume (ml) and microscopic characteristics: (AndroVision®, Minitüb
GmbH, Tiefenbach, Germany) Progressive motility (PM); Percent live with Eosin -
Nigrosin staining [% PV]; HOS test ([% rolled tails] post incubation in 50mOsm lactose
solution). Intact acrosomes (AI, % intact acrosomes) Filtered semen was diluted to a
concentration of 50 x106 per ml in a skim milk-glucose based diluent, stored at 4°C for
4 h and then frozen. In both stages, the semen was subjected to the microscopic contrast
tests described above. The data obtained were analyzed by ANOVA. Significance was
established as p≤0.05. Similar values of MP, VM, HOS and AI were observed in fresh
semen and after 4 hs of refrigeration. Likewise, the latter were compared with post-thaw
values (57.6±4.8 vs 20.07±5.8; 66.5±2.8 vs 60.9 ± 3.8, 66.5±3.5 vs 36.09±5.1; 80.4±2.6
vs 60.3±3.6 respectively). Our results suggest that refrigerated semen could be
transported and frozen after 4h of storage at 4°C, allowing collection in the field and
cryopreservation in a properly equipped laboratory without the need to transport the
equines. Future studies will allow to deepen the knowledge on refrigeration for short
periods prior to freezing.
Keywords: Equine - Semen - Cryopreservation
1. Introducción
El bienestar animal implica comprender que los animales son seres sintientes que
llegan a experimentar dolor o estrés, es así que causar sufrimiento no es
moralmente aceptable. Debido a esto, la cría y el trabajo con animales también
están afectadas, tanto en calidad como en el desempeño. Brindar bienestar animal
implica el compromiso de asegurar una buena calidad de vida, durante todo el
ciclo vital del animal, desde el nacimiento hasta la muerte (Sanmartín- Sánchez
2015). Es así que evitar el estrés y riesgos del transporte animal es una de las
metas en el bienestar equino. Los reproductores de gran desempeño deportivo son
ampliamente requeridos para servicios, lo que implica el traslado de las hembras
o de los padrillos para la realización de servicios. De esta manera el transporte del
semen refrigerado y su uso mediante inseminación artificial (IA) es una práctica
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rutinaria en reproducción equina la cual evita el transporte de animales, reduce
riesgos, estrés animal, costos de traslado y aumenta las posibilidades de uso de un
reproductor (Douglas- Hamilton 1987). En las últimas décadas la IA con semen
congelado en equinos ha adquirido gran importancia a partir de la aceptación de
su uso por varias asociaciones de criadores. La mencionada biotecnología permite
almacenar material genético de valor y utilizarlo incluso cuando los padrillos ya
no están disponibles, pudiendo distribuirse el material genético de un padrillo por
todo el mundo. La refrigeración de semen diluido y su almacenado por algunas
horas conservando parámetros seminales similares a los del semen fresco
permitiría trasladar el semen hasta un laboratorio para su posterior congelamiento.
Este hecho haría posible realizar la colecta de semen a campo y el traslado del
eyaculado permitiendo el congelamiento sin necesidad de trasladar a los padrillos
o contar con un laboratorio in situ.
2. Metodología
1. Animales Experimentales:
Se utilizaron 10 padrillos de raza Criolla Argentino de entre 5 y 8 años,
clínicamente sanos y fértiles con descendencia en las últimas 3 temporadas
reproductivas. Los animales se alojaron en boxes, con salidas diarias a piquetes,
se alimentaron con dieta balanceada y tuvieron acceso libre al agua.
Como criterio de aceptación de un macho como animal experimental se tomaron
los siguientes parámetros seminales: Concentración (CON) ≥ 170 x 106/ml,
Motilidad Progresiva (MOT) ≥60%, Vigor (VIG) ≥3-4, (Porcentaje de
espermatozoides vivos) PV ≥ 60%, Porcentaje de acrosomas normales (ACR) ≥
60%, Morfología espermática (ME) espermatozoides normales ≥60%, HOS ≥60%
de colas enrolladas (Sieme, 2009; Juhász J., 2000)
2. Colecta de Semen:
Los eyaculados fueron obtenidos a través de estimulación con una yegua en celo
durante la estación reproductiva (septiembre-diciembre), recolectando el semen
en una vagina artificial tipo Missouri (Estrada 2007).
3. Evaluación de la calidad seminal:
Las muestras de Semen fresco fueron sometidas a las siguientes pruebas de
evaluación
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3.3.1 Motilidad Progresiva (MP) una gota de 10 ul de semen fresco se colocó en
un portaobjetos limpio a 37°C, se cubrió con un cubreobjetos y se observó
mediante un sistema de análisis computarizado CASA (AndroVision®, Minitüb
GmbH, Tiefenbach, Germany) utilizando platina termostatizada, se estimó en
varios campos el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva
(Estrada, 2007).
3.3.2 Evaluación de Integridad de membrana. Porcentaje de vivos (PV), se colocó
10 ul de semen con 10 ul de colorante eosina-azul de anilina sobre un portaobjetos
a 37°C. Se mezclaron las gotas durante 30 segundos sobre platina térmica a 37°C.
Se realizó un extendido y se observó por microscopía a 1000 X (Estrada, 2007)
(Tittarelli, 2006)
3.3.4 Prueba de HOS (HOS). Se evaluó la funcionalidad de la membrana
espermática mediante la prueba de HOS agregando 100 μl de semen a 1000 μl de
una solución de 50mOsm de Lactosa. Se observó con microscopio de contraste de
fase a 400 X y se determinó el porcentaje de espermatozoides con colas enrolladas
(Neild, 1999; Neild, 2000; Wrench, 2010).
3.3.5 Acrosomas intactos (AI, % de acrosomas normales), una muestra de semen
se procesó para su estudio por microscopía de fluorescencia con el conjugado de
Pisum sativum aglutinin-isotiocianato de fluoresceína (Mendoza, 1992;
Zhuangyuan, 2015).
4. Diseño experimental
Se procesaron 16 eyaculados. El semen puro se filtró, y se determinó el volumen.
Se tomó una alícuota para determinar la concentración espermática (CE 106/ml),
la cual se calculó realizando el conteo en cámara de Newbauer (Samper, 2009)
este parámetro permitió realizar la dilución a 50 X106 / ml (Juhász J., 2000) con
un diluyente base leche descremada KENNEY (Palma, 2001; Samper, 2009), se
fraccionó en tubos Falcon de 50 ml, y y las muestras fueron colocadas en un
Equiteiner a 5°C. tras 4 hs de refrigeración, se realizaron las pruebas de
evaluación[on de la calidad seminal como se mencionó anteriormente, luego se
centrifugó a 275 G por 7 minutos (Cochram, 1984; Magistrini, 2000; Squieres,
2004), se descartó el sobrenadante y fue re-diluido en el DIL de congelación
Lactosa-EDTA- yema de huevo (Glucosa 59,985 g, Citrato de sodio, 2 H2O 3,7
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g, EDTA disodico 3,699 g, Bicarbonato de sodio (NaCO3H) 1,2 g. Polimixina B
sulfato 1 millón UI) con 20% de yema de huevo, 11% de lactosa, 5% de DMF.
Dos eyaculados (EYA) de cada padrillo se fraccionaron y mezclaron con un
volumen calculado de cada uno de los DIL descriptos para obtener una
concentración final de 200 x106 espermatozoides/ml. Luego del envasado en
pajuelas de 0,5 ml, el semen se equilibró 1,5hs a 4ºC y posteriormente se congeló
sobre vapores de nitrógeno líquido (Melo, 2007; Gomes 2002; Cochram, 1984).
La descongelación del semen se realizó a 37 ºC durante 1 minuto. El semen
congelado-descongelado fue sometido a las mismas pruebas de evaluación de la
calidad seminal mencionadas.
3. Análisis de los resultados
Los datos obtenidos fueron analizados mediante ANOVA. La significancia fue
establecida como p≤0,05.
No se observaron diferencias significativas entre MP, VM, HOS y AI en semen
fresco y luego de 4 hs de refrigeración. Así mismo, estos últimos se compararon
con los valores post descongelamiento (57,6±4,8 vs 20,07±5,8; 66,5±2,8 vs 60,9
± 3,8, 66,5±3,5 vs 36,09±5,1; 80,4±2,6 vs 60,3±3,6 respectivamente)
obteniéndose valores aceptables para su posterior uso mediante IA.
Tabla 1: Pruebas de contrastación realizadas al semen fresco y congelado-
descongelado
MP
PV
HOS
AI
REFRIGERADO
57,6±4,8a
66,5±2,8a
66,5±3,5a
80,4±2,6a
DESCONGELADO
20,07±5,8b
60,9±3,8b
36,09±5,1b
60,3±3,6b
Valores obtenidos en las Pruebas de contrastación realizadas al semen fresco y congelado-descongelado. Valores
expresados en promedios ± error estándar. Letras diferentes expresan diferencias (p≤ 0,05)
4. Conclusiones
En el presente estudio, se compararon La MP, PV, HOS Y AI entre semen fresco,
posterior a 4 hs de refrigeración y post descongelado. No se observaron diferencias
significativas entre el semen fresco y posterior a 4 hs de refrigeración, sin embargo, se
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observaron diferencias significativas entre este último y el semen congelado-
descongelado. Esto es esperable ya que las membranas espermáticas (plasmática y
acrosomal) son el principal sitio de impacto de los procesos de criopreservación y donde
ocurren los primeros daños celulares. Las bajas temperaturas ocasionan tanto daños
estructurales como funcionales que afectan la capacidad fecundante del espermatozoide.
Paralelamente, reducen su longevidad dando origen a cambios similares a la capacitación
(Colebrader, 2011).
No se encontraron diferencias significativas en los diferentes parámetros evaluados in
vitro cuando se compararon el semen fresco y posterior a 4 hs de refrigeración, lo que
permite hipotetizar que el uso del semen refrigerado para su posterior congelamiento en
el laboratorio tras 4 hs de refrigeración es altamente prometedor. Esta práctica haría
posible colectar la muestra en el campo sin la necesidad de transporte animal evitando los
riesgos de transporte tanto para el padrillo hacia el laboratorio para criopreservar semen,
como de las hembras hacia el centro de inseminación; pudiendo transportarse el semen
criopreservado. Implementando estas biotecnologías se impulsa el bienestar animal
preservando la salud equina.
5. Referencias bibliográficas.
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